ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE

1.      Amplificación de secuencias de ADN

1.1.    Reacción en cadena polimerasa

·         Permite multiplicar a voluntad un segmento dado de ADN en una muestra.

·         Primero  se  debe calentar el ADN, hasta su total desnaturalización, con la presencia de un exceso de oligonucleótidos (cebadores o “primers”).

·         Al enfriarse, se agrega ADN polimerasa y desoxirribonucleósidos trifosfato, para comenzar el ensamble de la nueva cadena, desde el extremo 3´; al terminar, el ADN ya se encuentra duplicado.

·         Comienza el segundo ciclo, con el mismo fin, pero esta vez, se ha cuadruplicado, la cantidad de trozos de ADN seleccionado.

1.1.1.  RT-PCR

·         Es el método utilizado para amplificar ARN mensajero.

·         El primer paso, es la transcripción in vitro de ARN mensajero.

·         Luego el ADN transcripto se amplifica mediante la PCR convencional.

1.1.2.  PCR a tiempo real (Q-PCR)

·         A diferencia de la PCR convencional; la Q-PCR  realiza en etapas iniciales de la reacción la estimación del ADN.

·         Permite determinar con relativa precisión la cantidad de ADN formado.

·         Para cuantificar el ADN, se utilizan dos tipos de moléculas fluorescentes.

·         Esta técnica se efectúa para determinar tanto los productos de la PCR convencional, con los de la RT-PCR.

2.      Clonación de genes

·         Es la obtención de numerosas copias de un segmento definido del genoma de un organismo dado.

2.1.    Preparación de ADN recombinante

·         El ADN aislado de células del organismo del cual deseamos obtener el gen, es seccionado en segmentos apropiados para su recombinación.

·         Luego los fragmentos de ADN, son introducidos en vectores adecuados (fagos), mediante el método de recombinación de ADN como los indicados.

·         Los fagos son introducidos en bacterias (E. coli).

·         Las bacterias se multiplican, y forman colonias separadas.

·         Segmentos de ADN copia (ADNc), pueden ser utilizados como sondas, para la localizar la colonia en la que se encuentra el gen deseado.

2.2.    Preparación de la sonda de ADNc

·         Se puede partir de células que sintetizan en cantidad las proteínas codificadas.

2.3.     Identificación del clon portado del gen

·         Se transfiere las colonias a un disco de nitrato de celulosa.

·         Las bacterias son lisadas, y su ADN es fijado al papel en el lugar que ocupaba la colonia original.

·         Luego se procede a la desnaturalización del ADN fijado.

·         Sobre esto, se vierte una solución del ADNc, también desnaturalizado.

·         Luego se produce una hibridación entre el ADNc radiactivo y el ADN fijado.

·         Se elimina el ADNc (por lavado), y se coloca una película radiográfica.

·         En los sitios donde se encuentran los ADN híbridos se impresiona la película, permitiendo ubicar, las colonias portadoras del gen que interesa.