ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE

1.      Amplificación de secuencias de ADN

1.1.    Reacción en cadena polimerasa

·         Permite multiplicar a voluntad un segmento dado de ADN en una muestra.

·         Primero  se  debe calentar el ADN, hasta su total desnaturalización, con la presencia de un exceso de oligonucleótidos (cebadores o “primers”).

·         Al enfriarse, se agrega ADN polimerasa y desoxirribonucleósidos trifosfato, para comenzar el ensamble de la nueva cadena, desde el extremo 3´; al terminar, el ADN ya se encuentra duplicado.

·         Comienza el segundo ciclo, con el mismo fin, pero esta vez, se ha cuadruplicado, la cantidad de trozos de ADN seleccionado.

1.1.1.  RT-PCR

·         Es el método utilizado para amplificar ARN mensajero.

·         El primer paso, es la transcripción in vitro de ARN mensajero.

·         Luego el ADN transcripto se amplifica mediante la PCR convencional.

1.1.2.  PCR a tiempo real (Q-PCR)

·         A diferencia de la PCR convencional; la Q-PCR  realiza en etapas iniciales de la reacción la estimación del ADN.

·         Permite determinar con relativa precisión la cantidad de ADN formado.

·         Para cuantificar el ADN, se utilizan dos tipos de moléculas fluorescentes.

·         Esta técnica se efectúa para determinar tanto los productos de la PCR convencional, con los de la RT-PCR.

2.      Clonación de genes

·         Es la obtención de numerosas copias de un segmento definido del genoma de un organismo dado.

2.1.    Preparación de ADN recombinante

·         El ADN aislado de células del organismo del cual deseamos obtener el gen, es seccionado en segmentos apropiados para su recombinación.

·         Luego los fragmentos de ADN, son introducidos en vectores adecuados (fagos), mediante el método de recombinación de ADN como los indicados.

·         Los fagos son introducidos en bacterias (E. coli).

·         Las bacterias se multiplican, y forman colonias separadas.

·         Segmentos de ADN copia (ADNc), pueden ser utilizados como sondas, para la localizar la colonia en la que se encuentra el gen deseado.

2.2.    Preparación de la sonda de ADNc

·         Se puede partir de células que sintetizan en cantidad las proteínas codificadas.

2.3.     Identificación del clon portado del gen

·         Se transfiere las colonias a un disco de nitrato de celulosa.

·         Las bacterias son lisadas, y su ADN es fijado al papel en el lugar que ocupaba la colonia original.

·         Luego se procede a la desnaturalización del ADN fijado.

·         Sobre esto, se vierte una solución del ADNc, también desnaturalizado.

·         Luego se produce una hibridación entre el ADNc radiactivo y el ADN fijado.

·         Se elimina el ADNc (por lavado), y se coloca una película radiográfica.

·         En los sitios donde se encuentran los ADN híbridos se impresiona la película, permitiendo ubicar, las colonias portadoras del gen que interesa.

VITAMINAS

 VITAMINAS

Se dividen en dos grupos:

·         Liposolubles ( A, D, E Y K)

1.       Se almacenan en el hígado, produciendo toxicidad, cuando están en exceso.

2.       No se absorben, ni se excretan fácilmente.

·         Hidrosolubles (B Y C )

1.       Se requieren en la dieta

2.       No se almacenan en grandes cantidades

3.       Su exceso (dentro de lo razonable), no resulta tóxico.

1.    Vitaminas Liposolubles:

1.1.   Vitamina A (retinol)

·           Se absorbe en la mucosa intestinal, y son transportados al hígado por quilomicrones.

·           Hay 3 formas activas de la vitamina A: Ácido retinoico (hormona esteroidea, se liga a la cromatina para para controlar el crecimiento y diferenciación de las células en la piel), Retinal (se una a la opsina para formar rodopsina), B – caroteno (antioxidante).

2.6.1.  Deficiencia: (Baja ingesta)

·         Resequedad de la piel.

·         Falta de visión

·         Alteración funcional de la mucosa.

2.6.1.  Toxicidad: (Hipervitaminosis A)

·         Piel seca

·         Defectos de la mucosa y pérdida de cabello

·         Hepatomegalia

·         Aumento de presión intracraneal

1.2.    Vitamina D3 (colecalciferol)

·           Se fabrica en la piel mediante la acción de la luz solar

·           Sufre dos reacciones, una en el hígado, y la segunda en el riñón. (25 - hidroxicalciferol y 1, 2 – dihidroxicalciferol, respectivamente)

·           Aumenta la captación de calcio desde el intestino.

·           Aumenta la reabsorción de calcio desde el riñón.

·           Aumenta la resorción de hueso, para liberar calcio.

1.2.1. Deficiencia: (Falla en el hígado, riñón; o falta de radiación solar)

·         Raquitismo     (niños)

·         Osteomalacia (adultos)

·         Alteración de la homeostasis del calcio.

1.2.2.  Toxicidad: (la más tóxica)

·         Nauseas

·         Debilidad muscular

·         Hipercalcemia, depositándolo en tejidos como las arterias.

1.3.    Vitamina E (Tocoferol)

·           Se encuentra disuelto en la grasa de la dieta, absorbiéndose con ella.

·           Es transportado desde el hígado por proteínas de muy baja densidad (VLDL).

·           Se almacena en tejido adiposo

1.3.1.  Deficiencia: (Raro; en prematuros,  por la baja capacidad de almacenamiento)

·         Anemia hemolítica

·         Ataxia

·         Nistagmo

1.3.2.  Toxicidad:

·         Menos tóxica de las vitaminas liposolubles

1.4.    Vitamina K

·           Se obtiene de la dieta, pero la mayor parte, es sintetizada por las bacterias del intestino.

·           Coenzima utilizada para la carboxilación de residuos de glutamato, de los factores de coagulación (II, VII, IX Y X)

1.4.1.  Deficiencia: (Baja cantidad de bacterias intestinales, ingesta de warfarina)

·           Niveles bajos de los factores de coagulación, por lo que se inhibe la cascada de coagulación, presentando hemorragias y formación de hematomas.

2.       Vitaminas Hidrosolubles

2.1.    Vitamina B1 (Tiamina)

·            Actúa como cofactor de  cuatro enzimas: Piruvato deshidrogenasa, a - cetoglutarato deshidrogenasa, deshidrogenasa de a - cetoácido de cadena ramificada.

2.6.1. Deficiencia: (Disminución de las enzimas, en las que actúa).

·           Acumulación de Piruvato y lactato

·           Disminución de la formación de acetil COA y ATP

·           Beriberi

·           Síndrome de Wernicke – Korsakoff

2.1.2.  Toxicidad: (Infrecuente)

·           Cefalea

·           Insomnio

·           Dermatitis

2.2.    Vitamina B2 (Riboflavina)

·            Flavina mononucleótido (FMN)

·            Flavina adenina dinucleótido (FAD)

·            Actúan como coenzimas

2.6.1. Deficiencia: (Rara, excepto en ancianos o alcohólicos).

·           Estomatitis  (inflamación en los lados de la boca)

·           Queilosis ( fisuras en las comisuras de la boca)

·           Cataratas

·           Glositis (inflamación de la lengua)

2.3.    Niacina o ácido nicotínico

·            Se sintetiza con las proteínas de la dieta, en cantidades muy grande

·            NAD y NADP, son sus formas activas.

2.6.1. Deficiencia: (Rara, excepto en ancianos o alcohólicos).

·           Pelagra

·           Síntoma de las 3 D

2.3.2.  Toxicidad

·           Sofocos

·           Vasodilatación.

2.4.    Vitamina B6

·           Existe en tres formas: Piridoxina, piridoxal y piridoxamina

·           Las tres formas, se convierte en coenzima fosfato de piridoxal.

2.6.1. Deficiencia: (Rara, en niños con leche artificial, personas mayores y alcohólicos).

·           Metabolismo anómalo de los aminoácidos.

·           Pelagra secundaria

·           Convulsiones y depresiones

2.3.2.  Toxicidad

·           Neuropatía de sensitiva.

2.6.    Ácido pantoténico

·         Componente de la coenzima A, en transferencia del grupo acilo.

2.6.1. Deficiencia: (Rara).

·           Síndrome de los pies ardientes.

2.6.    Vitamina B12: cobalamina

·         Transportador de grupos metilo

2.6.1. Deficiencia: (Rara).

·           Déficit de folato “artificial” secundario.

·           Anemia perniciosa

2.6.    Folato

·         Transportador de grupos metilo

2.6.1. Deficiencia: (Embarazo, anemias hemolíticas).

·           Falta de crecimiento

·           Anemia megaloblástica

2.6.    Vitamina C: ascorbuto

·         Poderoso agente reductor, antioxidante

2.6.1. Deficiencia: (Embarazo, anemias hemolíticas).

·           Disminución de la falta de colágeno, por lo tanto produce mal formación del tejido conjuntivo, y dificultad de cicatrización.

Metabolismo de Purinas y Pirimidinas

METABOLISMO DE PURINAS Y PIRIMIDINAS.

•        S – ADENOSIL METIONINA: Principal donante, de grupo Metilo
•         Folato: Se activa en tetrahidrofolato (THF); este transporta unidades mono carbonadas, ligadas en los átomos de nitrógeno

1.       PURINAS:

·         Dos anillos, de 6 y 5 carbonos.

·         Pueden estar libres, o unidas con un azúcar (pentosa), en la posición N9, formando un nucleósido.

·         Según el ácido ortofosfórico, puede ser: mono, di o tri nucleótido.

a.       ADN, construcción: ADENINA Y GUANINA

b.      Cofactores de adenina: NAD, FAD, CoA

c.       Energía: ATP, GTP, AMP

d.      Reguladores: ATP, ADP. NAD

e.      Señalización: AMPc, GMPc, GTP, proteínas G

f.        Neurotransmisores: GMPc

1.1.  Metabolismo (SINTESIS):

1.1.1.   Síntesis de Novo de Purinas: (CITOSOL, HEPATOCITOS)

1.1.1.1.       Formación de Inositol Monofosfato (IMP), en once reacciones.        (LOS NITRÓGENOS DEL ANILLO, PROVIENEN DEL ASPARTATO, GLICINA Y GLUTAMINA).

1.1.1.2.       Conversión del IMP a AMP Y GMP

1.1.2.   Vías de Recuperación: La ribosa 5-fosfato es transferida del PRPP a las bases libres, siendo una reacción irreversible, requiere menos ATP; utiliza dos enzimas: Adenina Fosforribosil Transferasa, e Hipoxantina guanina fosforribosil transferasa.

1.2.    Síndrome de Lesch – Nyhan: Ausencia de la enzima de recuperación hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT); provocando aumento de hipoxantina y guanina, y aumento del (PRPP), causando alteraciones neurológicas graves.

1.3.    Degradación de purinas:

1.3.1.  De nucleótido a una base libre: hipoxantina (desde AMP e IMP) o xantina (desde GMP) , se produce en tres fases:

1.3.1.1.       Eliminación del grupo fosfato.

1.3.1.2.       Eliminación de la ribosa.

1.3.1.3.       Liberación del grupo amino.

2.       PIRIMIDINAS:

2.1.    Biosíntesis de las pirimidinas

2.1.1.   Construcción del anillo pirimidina, para formar Monofosfato de uridina (UMP), este (el anillo) se sintetiza primero antes de la unión de la ribosa 5 – fosfato, EL ANILLO DERIVA DE LA GLUTAMINA, EL ASPARTATO Y EL CO2.

2.1.2.  Conversión del UMP a UTP y CTP (Trifosfato de citidina); El UMP, se convierte en UDP y UTP; el UTP forma CTP, por aminación (agregación de un grupo NH2). UTP y CTP, se utiliza para la síntesis de ARN.

2.1.3.  Formación de los desoxirribonucleótidos dCTP y dTTP del ADN.

2.2.     Regulación de la síntesis de pirimidina: Se inhibe la carbomil fosfato sintasa II. La CSPSII, inhibida por la UDP y UTP, la reacción es activada por ATP y PRPP.

2.3.    Vías de Recuperación: La Uracil timina fosforribosil transferasa (UTPRT), junta a la ribosa 5 – fosfato del PRPP, pero la UTPRT, no puede recuperar citosina, esta se desamina a uridina, que a su vez se convierte en uracilo.

2.4.    Degradación de las pirimidinas: Se excretan, con el anillo intacto, pero el anillo puede ser roto, y descompuesto a estructuras más solubles.

·         Uracilo y citosina, se descompone en B – alanina, que forma acetil CoA.

·         Timina es degradada a B-aminoisobutirato, que forma sucinil CoA.

• ·         Los esqueletos carbonados, pueden ser oxidados por el ciclo del ATC.

AFILACIÓN SIS

ESTAMOS EN LA ELABORACIÓN Y FUTURA PUBLICACIÓN DE UNA CARTA AL EDITOR, A CONTINUACIÓN UNO DE LOS AVANCES QUE TENEMOS, HACE UNOS DÍAS LO ENVIAMOS A UNA REVISTA MÉDICA, ESPEREMOS LO ACEPTEN.

Una problemática que se ve en las zonas con bajos recursos, en nuestro país (Perú),sobre todo por la falta de compromiso, de las autoridades responsables, en dar la información NECESARIA Y COMPLETA, sobre los programas de salud donde se encuentran afiliados millones de personas con bajos recursos económicos, y la mayoría de estos se encuentras desinformados total o parcialmente.

CARTA AL EDITOR: PROBLEMÁTICA DE AFILIACIÓN AL SIS.

Autores: Requelme Portocarrero, Kimberly; Silva Fiestas Jorge Enrique; Delgado Sipión Gonzalo.

Sr. Editor. El sistema de salud peruano se caracteriza por su heterogeneidad estructural. Gran parte del problema se evidencia en la población de bajos recursos; quienes no tienen seguro de salud ni están afiliados a un sistema de previsión social, o están afiliados al Seguro Integral de Salud (SIS) pero aun así desconocen sobre la información acerca del seguro; lo que los ubica en una condición de alta vulnerabilidad. Esto conlleva a la disconformidad de la población, quienes refieren no conocer mucho acerca del sistema y nos comentan las quejas que tienen acerca de este.¹

Uno de los factores que limita a la población pobre a formar parte de este sistema, es la falta de conocimiento sobre este. En base a una experiencia personal, en la cual encuestamos a personas que vivían en la zona marginal del distrito de Lambayeque, notamos que muchas de ellas carecían de información  y conocimiento al respecto de lo que es el SIS.³

En un informe de afiliación, elaborado por el SIS; señalan que a pesar de haber aumentado considerablemente las afiliaciones, aún existen debilidades en las estrategias de difusión para afiliarse, ya que un 39 % de la población se enteró por amigos, vecinos, promotores de salud, familiares, por el colegio o por la organización en la que participan.⁴

Uno de  los factores que dificultan este proceso de afiliación es el tiempo excesivo que se utiliza para realizarse. Otro factor que contribuyen a este hecho, se evidencia en las personas en extrema pobreza que no cuentan con sus documentos personales por no tener recursos económicos para acceder a obtenerlos; también resalta el poco personal que lleva a cabo la visita domiciliaria, con el fin de confirmar si la persona es pobre o extremadamente pobre y  esto conlleva a la demora en la elaboración de la Ficha de Evaluación Socioeconómica Familiar (FESE) para pasar la información al sistema computarizado.⁴

Así mismo; los pobladores no cuentan con toda la información necesaria y suficiente acerca del SIS, y aun estando afiliados el conocimiento acerca de este es escaso; muchos no reciben información acerca de la cobertura de su seguro, y acerca de las exclusiones, es decir, sobre lo que no cubre el seguro. Esto trae consigo una serie de problemas e incomodidades para los pacientes al momento de ir a ser atendidos, dónde recién son informados acerca de qué el motivo por el cual van a atenderse no es cubierto por su seguro y no pueden ser atendidos. Esto se debe a la falta de personal y la gran demanda de la población para afiliarse; y pesar que algunos casos el seguro no cubre, el asegurado debe estar totalmente informado.⁴

Por otro lado, el trato del personal indica un factor importante para el acceso al servicio, pues debemos tener en cuenta que son quienes representan el inicio del circuito para acceder a los servicios de salud, pues una gran mayoría reportara recibir un mayor maltrato por parte del personal de admisión.⁴

En conclusión, se debería mejorar la problemática mencionada basándose en una mejor organización del sistema e implementación de personal; ya que como lo mencionamos antes, existe una gran demanda de afiliados; el cual es un factor limitante para el acceso a los servicios de salud que se brinda a los asegurados. También es necesaria la capacitación a personas que vayan a afiliarse, considerando también a las migrantes; y a aquellas que ya estén afiliadas, ya que el hecho de que estén afiliadas no significa que estén totalmente informados acerca del sistema. También se deberían mejorar las estrategias de comunicación del SIS hacia la población,  dando capacitaciones grupales o a los agentes comunitarios para que difundan el mensaje a su comunidad; y así mejorar el conocimiento de esta población acerca de la afiliación e información sobre derechos y deberes que poseen al estar asegurados⁴

1. INEI [Sede Web]. Perú: INEI, 2012 [acceso 16 de Octubre de 2014]. Acceso a seguro de salud y prevención social. [56 páginas]. Disponible en: http://www.inei.gob.pe/media/MenuRecursivo/publicaciones_digitales/Est/Lib1105/cap05.pdf 

2. Madueño M, Sanabria CA. Estudio de oferta de los servicios de salud en el Perú y en el análisis de brechas 2003-2020. Bethesda: Partners for Health Reform plus; 2002.

3.  Instituto Nacional de Estadística e Informática. Censos nacionales 2007: XI de Población y VI de Vivienda. Lima: INEI; 2008.

4. Autor. Reporte de la Vigilancia Ciudadana al Seguro Integral  de Salud - SIS-, en establecimientos de Salud de Lima Metropolitana [Internet]. 2008 [ acceso 29 de octubre del 2014]. Disponible en: http://www.forosalud.org.pe/publicacion_reporte_de_vigilancia.pdf 

El Ebola

La OMS ha publicado recientemente, información referente al virus de ébola, que amenaza en convertirse en una epidemia.

Datos y cifras (Según OMS)

• Causa en el ser humano la enfermedad homónima (antes conocida como fiebre hemorrágica del Ebola).
• Los brotes de enfermedad por el virus del Ebola (EVE) tienen una tasa de letalidad que puede llegar al 90%.
• Los principales brotes se dieron en lugares remotos de África central y occidental, cerca de la selva tropical.
• El virus es transmitido al ser humano por animales salvajes y se propaga en las poblaciones humanas por transmisión de persona a persona.
• Se considera que los huéspedes naturales del virus son los murciélagos frugívoros de la familia Pteropodidae.
• No hay tratamiento específico ni vacuna para las personas ni los animales.

La primera aparición del virus fue en 1976 en dos brotes simultáneos ocurridos en Nzara (Sudán) y Yambuku (República Democrática del Congo). La aldea en que se produjo el segundo de ellos está situada cerca del río Ebola, que da nombre al virus.

El género Ebolavirus es, junto con los géneros Marburgvirus y Cuevavirus, uno de los tres miembros de la familia Filoviridae (filovirus). El género Ebolavirus comprende cinco especies distintas:

• ebolavirus Bundibugyo (BDBV);
• ebolavirus Zaire (EBOV);
• ebolavirus Reston (RESTV);
• ebolavirus Sudan (SUDV), y
• ebolavirus Taï Forest (TAFV).

Transmisión

Prevención y tratamiento

No hay vacuna, ni tratamiento contra la EVE. Se están probando varias, pero ninguna está aún disponible para uso clínico.

Los casos graves requieren cuidados intensivos. Los enfermos suelen estar deshidratados y necesitar rehidratación por vía intravenosa u oral con soluciones que contengan electrólitos.

Prevención

Prevenciones dadas, por la OMS:

1. Control del virus del Ébola de Reston en animales domésticos
2. Limpieza y desinfección regulares (con hipoclorito sódico u otros detergentes) de las granjas de cerdos y monos es eficaz para inactivar el virus. Si se sospecha que se ha producido un brote, los locales deben ponerse en cuarentena inmediatamente.
3. Sacrificar a los animales infectados, supervisando estrechamente la inhumación o incineración de los cadáveres. La restricción o prohibición del movimiento de animales de las granjas infectadas a otras zonas puede reducir la propagación de la enfermedad.

Respuesta de la OMS

La OMS aporta conocimientos especializados y documentación para apoyar la investigación y el control de la enfermedad.

El documento Interim infection control recommendations for care of patients with suspected or confirmed Filovirus (Ebola, Marburg) haemorrhagic fever, marzo de 2008, que está siendo actualizado, contiene recomendaciones acerca de cómo evitar la infección cuando se proporciona asistencia médica a pacientes con EVE presunta o confirmada.

La OMS ha elaborado una lista de verificación de las precauciones generales que se han de adoptar en la asistencia médica (en fase de actualización). Esas precauciones están concebidas para reducir el riesgo de transmisión de agentes patógenos, entre ellos los de origen sanguíneo; su aplicación universal ayudará a prevenir la mayoría de las infecciones transmitidas por exposición a sangre o líquidos corporales.

Se recomienda aplicar las precauciones generales cuando se atienda y trate a cualquier paciente, independientemente de que sea un caso de infección presunta o confirmada. Estas precauciones representan el nivel básico de control de las infecciones e incluyen la higiene de las manos, el uso de equipo de protección personal para evitar el contacto directo con sangre y líquidos corporales, la prevención de los pinchazos de aguja y las lesiones con otros instrumentos cortopunzantes, y un conjunto de medidas de control ambiental.